La polifonia raggiunse il suo massimo sviluppo e la sua più alta capacità espressiva nel pieno Rinascimento, ossia nel Cinquecento. In quest' epoca ogni stato grande o piccolo, ogni corte reale o signorile, aveva la sua cappella, cioè la sua scuola di canto e musica, diretta dal maestro di cappella, scelto fra i migliori musicisti. Celebre al pari di Josquin Desprès fu Orlando di Lasso, musicista fiammingo che operò presso le corti di mezza Europa dedicandosi sia al madrigale profano che alla musica sacra: di lui si contano ben 58 messe.

Ma nel campo della musica sacra il compositore più celebre, e celeberrimo ancor oggi, fu Pier Luigi da Palestrina, che compose oltre 100 messe e una quantità di altri pezzi per tutte le diverse occasioni liturgiche. Visse sempre a Roma, ma in tutta l'Europa fu acclamato ed esaltato come il "principe della musica". La scuola polifonica di Venezia si distinse da quella romana per l'uso di due cori e l'accompagnamento strumentale al canto. Nella basilica di San Marco vi erano due cantorie alle estremità opposte del transetto, con due organi e due complessi strumentali. Fra i tanti apprezzati musicisti della cappella di San Marco si distinse in particola­re Andrea Gabrieli, che fu un grande organista e tra i primi a dedicarsi anche a composizioni solo strumentali. Nella musica profana, grandi autori di madrigali furono Luca Marenzio e Carlo Gesualdo da Venosa, il primo attivo in molte corti europee, il secondo soprattutto a Napoli. In Germania i cantori vaganti del Medioevo si trasformarono ora nei Meistersinger o "Maestri cantori" e si stabilirono nelle città.

La Riforma protestante, che interessò tutta la Germania, si ripercosse anche sulla musica sacra che, nell'intento di avvicinare maggiormente i fedeli alle cerimonie del culto, adottò i canti popolari in lingua tedesca. Questi "corali", rielaborati in seguito da grandi musicisti, divennero la base dell'alta tradizione della musica sacra, vocale e strumentale, tipica della Germania.